Frage:
Sind mitochondriale Gene wie ribosomale Gene in scRNA-seq auszuschließen?
gc5
2018-01-20 03:49:02 UTC
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In dieser Antwort wird angegeben, dass ribosomale Gene vor der Normalisierung in scRNA-seq als Kontaminanten ausgeschlossen werden sollten.

Müssen auch mitochondriale Gene ausgeschlossen werden? Ich habe die Top 50 exprimierten Gene für einen bestimmten Datensatz aufgezeichnet und sie treten häufig auf (zum Beispiel MT-ATP6). Ich gehe davon aus, dass sie, da sie für die Mitochondrienfunktion wirken und möglicherweise stark exprimiert werden, das Signal des Gendifferentials über Zelltypen hinweg verdünnen können, jedoch in niedrigeren Konzentrationen exprimiert werden. Ist das biologisch einwandfrei?

Zusätzlich werden in diesem Kurs mitochondriale Gene verwendet, um Zellen zu filtern, wenn sie über einem bestimmten Verhältnis der Gesamt-RNA einzelner Zellen beitragen. Ich konnte jedoch keine Erklärung für diese Filterung finden. Welchen zugrunde liegenden Prozess wird mit diesem Verfahren berücksichtigt?

Es lohnt sich, zwischen dem ribosomalen RNA-Gen (Rn45s) und den vielen Genen zu unterscheiden, die für ribosomales Protein kodieren (die mit RPS, RPL, MRPS oder MRPL beginnen). mRNAs für ribosomale Proteinuntereinheiten sind ein Zwischenstadium, das für die Proteinproduktion verwendet wird. Möglicherweise fangen Sie einige glückliche Kopien der ribosomalen RNA (Rn45s), die kürzlich transkribiert wurden und noch nicht verarbeitet wurden. Abhängig von Ihrem RNA-seq-Protokoll besteht jedoch die Möglichkeit, dass sie eher als funktioneller Teil des Ribosoms als als Zwischenprodukt fungieren Bühne.
Zwei antworten:
gc5
2018-01-20 05:02:16 UTC
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Nach Angaben von Ilicic et al. (2016) zur Hochregulation von mtRNA in gebrochenen Zellen:

Es gibt eine umfangreiche Literatur zur Beziehung zwischen mtDNA, mitochondrial lokalisierten Proteinen und Zelltod [34, 35]. Eine Hochregulierung der RNA-Spiegel von mtDNA in zerbrochenen Zellen deutet jedoch auf Verluste im zytoplasmatischen Gehalt hin. In einer Situation, in der die Zellmembran gebrochen ist, geht zytoplasmatische RNA verloren, aber in den Mitochondrien eingeschlossene RNAs bleiben erhalten [...]

Demnach denke ich, dass die mtRNA-Spiegel relativ sind zu endogener RNA kann als Kontrolle für (gebrochene) Zellen von geringer Qualität verwendet werden, ähnlich wie bei ERCC-Spike-Ins. Ilicic T, Kim JK, Kolodziejczyk AA, Bagger FO, McCarthy DJ, Marioni JC, Teichmann SA. Klassifizierung von Zellen geringer Qualität aus Einzelzell-RNA-Sequenzdaten. Genombiologie. 2016, 17. Februar; 17 (1): 29.

Dies ist richtig, obwohl ich hinzufügen möchte, dass die Häufigkeit von mtRNA zwar auf gebrochene Zellen hinweist, Analysten jedoch sicherstellen sollten, dass die Filterung auf der Grundlage von "Prozent mtRNA" vom vorliegenden Datensatz und nicht von einem harten Schwellenwert geleitet wird. Ich habe gesehen, dass mehrere Analysten alle Zellen mit mehr als 5% mtRNA ausschließen, nur weil dies in [einem Seurat-Tutorial] (https://satijalab.org/seurat/pbmc3k_tutorial.html) durchgeführt wird. In der Praxis ist der Schwellenwert (a) willkürlich, (b) kann variieren und (c) sollte durch Sichtprüfung informiert werden.
Devon Ryan
2018-07-26 18:24:53 UTC
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Mitochondriale Gene müssen nicht immer entfernt werden, obwohl Sie dies möglicherweise aus verschiedenen technischen Gründen tun müssen.

Mitochondriale Reads unterscheiden sich von Natur aus von rRNA aufgrund von rRNA wird normalerweise während der normalen Bibliotheksvorbereitung ausgeschlossen (daher ist alles, was übertragen wird, im Wesentlichen eine Verunreinigung). Einige scRNAseq-Programme (z. B. RaceID) können in verschiedenen Stadien Stichproben verwenden, die unterbrochen werden können, wenn ein Großteil Ihres Signals an mitochondriale Transkripte gesendet wird. Dann ist es nicht so, dass sie ausgeschlossen werden sollten, weil sie aus Mitochondrien stammen, sondern dass die Ergebnisse stark durch das Vorhandensein SEHR hochexprimierter Gene beeinflusst werden und Ihre Ergebnisse verdächtig sind, wenn Sie diese RNAs nicht entfernen. Wenn Ihre Methoden davon nicht betroffen sind (z. B. wenn Sie robustere Skalierungsmethoden verwenden) oder wenn Sie keine super hohe Expression von mtRNA haben, ist dies nicht explizit erforderlich.

Außerdem sind Sie manchmal sehr möchte mtRNAs behalten, da Sie möglicherweise an Stoffwechselveränderungen interessiert sind. Da ich in einem Institut arbeite, das sich teilweise der Immunologie widmet, betrachten wir oft Dinge wie metabolische Veränderungen, die an der Immunaktivierung beteiligt sind, und das Entfernen von mtRNAs würde dies behindern. Wenn Sie jedoch a priori nicht am Stoffwechsel interessiert sind, ist es nicht unangemessen, Gene auszuschließen, die Sie nicht interessieren.



Diese Fragen und Antworten wurden automatisch aus der englischen Sprache übersetzt.Der ursprüngliche Inhalt ist auf stackexchange verfügbar. Wir danken ihm für die cc by-sa 3.0-Lizenz, unter der er vertrieben wird.
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