Ich persönlich glaube nicht, dass BQSR einen großen Einfluss auf das Aufrufen von Varianten hat, aber Sie müssen nicht wirklich raten. Wenn Sie GATK BQSR ausführen, werden eine Tabelle und Diagramme ausgegeben, in denen genau angegeben ist, wie viele Qualitätsfaktoren angepasst wurden. Die Anpassung hängt von der Position im gelesenen und genomischen Kontext ab (vorherige und folgende Basis). Nach meiner Erfahrung beträgt der Unterschied höchstens einige Punkte, ist aber sicherlich spürbar.

GATK empfiehlt BQSR sowohl für Genom- als auch für Exomdaten, die normalerweise viel höher als 15x sind.

Das ist eine gute Frage.

Ich würde sagen, dass Sie sich nicht um die Neukalibrierung von Varianten für

• geringe Anzahl von Proben (z. B. nur zwei) kümmern müssen Trios); Ich konnte die GTAK-Neukalibrierung von Varianten-Scores ohnehin nicht zum Funktionieren bringen.
• Proben mit hoher Abdeckung (z. B. X Ten-Genome mit 30-facher Abdeckung), bei denen die DNA-Proben selbst von hoher, vergleichbarer Qualität sind und mit konsistenter Sequenziert wurden Technologie.

Generell habe ich den Eindruck, dass viele der in GATK integrierten Gedanken und fortschrittlichen statistischen Modelle aus früheren Phasen des 1000-Genom-Projekts stammen. Dies bedeutet (1) Genome mit geringer Abdeckung, (2) Genome mit unterschiedlicher Abdeckung (3), die mit unterschiedlichen Technologieversionen durch (4) unterschiedliche Proben und (5) Populationssequenzierung sequenziert wurden.

Wenn Sie sich in einer klinischen Umgebung befinden Wenn Sie ohnehin nur 30x auf X Ten-Plattformen sequenzieren, hilft Ihnen die Neukalibrierung von Varianten wahrscheinlich nicht so viel.

Wenn Sie dagegen viele Datensätze aus verschiedenen Rechenzentren und Maschinenversionen usw. integrieren Eine Neukalibrierung von Varianten ist möglicherweise einen Versuch wert.

Eine gute Überprüfung würde darin bestehen, die Verteilung der Genotypqualität und andere varianten- / qualitätsbezogene Metriken vor und nach der Neukalibrierung zu untersuchen.

Jeder: Bitte korrigieren ich, wenn ich falsch liege!

Idealerweise wurden diese BQSR-Methoden unter Berücksichtigung der Tatsache durchgeführt, wie technische Fehler die Basisqualitätsaufrufe tatsächlich vermasseln und wann sich die Maschinen noch in der Entwicklungsphase befanden, während sie für das 1000G-Projekt verwendet wurden. Ab sofort sind Maschinen leistungsfähiger und leistungsfähiger, wenn es unwahrscheinlich ist, dass sie verwendet werden. Wir verwenden sie jedoch mit aufgelisteten SNPs, um die Kovariaten zu finden und ein Modell um die Daten herum zu erstellen, indem wir die Informationen mit Tricks des maschinellen Lernens verwenden, um die Qualität dieser Basisaufrufe zu verbessern . Idealerweise sollte es angemessener sein, wenn alte Maschinen von Illumina oder anderen Standardfirmen verwendet werden, aber bei neuen Maschinen, die sehr leistungsfähig sind und einen hohen Durchsatz haben, sollten sie dazu neigen, zu sinken. Ich erinnere mich nicht, ob solche Tests durchgeführt wurden, aber ich weiß natürlich, dass neue Sequenziermaschinen solche Tests immer durchführen, um zu zeigen, dass sie solche Fehler reduziert haben, aber dennoch einen solchen BQSR für Variantenaufrufe empfehlen. Das Problem ist nun die Liste der SNPs. Für mich ist dies das eigentliche Problem, da die Liste, die wir verwenden, weit davon entfernt ist, Goldstandard zu sein, und wenn dies nicht richtig erledigt wird, ist alles, was wir über Qualität schließen, immer noch wackelig. Dieser Link ist ziemlich informativ, aber er ist alt. Ich würde wirklich Verbesserungen mit neuen Sequenzern sehen. Allerdings interessieren sich sehr wenig Menschen für solche Tests in der akademischen Forschung und auch für das Translationslabor. Sie werden wirklich keine Zeit und kein Geld dafür investieren, es sei denn, die Einrichtung verfügt über einige Bioinformatiker, die solche Tests immer durchführen, während sie einen neuen Sequenzer für das Institut kaufen. In Bezug auf die klinische Genomik zum Auffinden von Varianten denke ich, dass die leistungsstärksten und aktuellsten Sequenzer verwendet werden sollten, aber nicht sicher sind, ob sie noch BQSR verwenden und wenn ja, welche Liste sie verwenden, um ein Modell der Kovariation um die Daten herum zu erstellen.

Falls BQSR keine Option ist (d. h. Nichtmodellorganismen), ist es am besten, eine interne Kontrollsequenz wie PhiX für die Illumina-Plattform zu verwenden. Obwohl dies gängige Praxis sein soll, ignorieren einige Einrichtungen dies. Grundsätzlich sollten die Maschinen diese Sequenzen als Referenz verwenden, damit die Bewertung genauer ist. Nach meiner Erfahrung hatten die ersten 10-15 Basen der Illumina-Reads immer eine geringere Qualität. Dies ist leicht an den Nukleotidverteilungen zu erkennen. Ich würde empfehlen, die ersten 10-15 Basen zu trimmen und das qualitätsbasierte End-Trimmen durchzuführen, wenn die Qualität der einzelnen Lesevorgänge wichtig ist, z