Die früheste Erwähnung des 30x-Paradigmas, das ich finden konnte, ist im Original-Sequenzierungspapier für das gesamte Genom von Illumina: Bentley, 2008. In Abbildung 5 zeigen sie insbesondere, dass die meisten SNPs gefunden wurden und dass es bis zum Erreichen des 30-fachen nur wenige nicht abgedeckte / nicht aufgerufene Basen gibt:

Heutzutage 30x ist immer noch ein gängiger Standard, aber große Keimbahn-Sequenzierungsprojekte drängen oft näher an 25x heran und finden ihn angemessen. Jede Gruppe, die dies ernsthaft tut, hat Leistungsberechnungen basierend auf den Besonderheiten ihrer Maschinen und Vorbereitungen durchgeführt (Dinge wie Fehlerraten und Leselängen sind wichtig!).

Die Krebsgenomik geht in die andere Richtung. Wenn Sie mit Reinheit, Ploidie und subklonalen Populationen zu kämpfen haben, ist viel mehr Abdeckung als 30x erforderlich. Unsere Gruppe hat in dieser Veröffentlichung von 2015 gezeigt, dass selbst bei einer 300-fachen Gesamtgenomabdeckung eines Tumors wahrscheinlich echte seltene Varianten eines Tumors fehlten.

Insgesamt hängt die Sequenzabdeckung, die Sie benötigen, wirklich davon ab, welche Fragen Sie stellen, und ich würde jedem empfehlen, der ein Sequenzierungsexperiment entwirft, sich vorher mit einem Sequenzierungsexperten und einem Statistiker zu beraten (und das ist es auch) noch besser, wenn das die gleiche Person ist!)

Solexa Inc. sequenzierte NA12878 chrX Anfang 2007 auf ~ 30x, was später Teil von Bentley (2008) wurde. Ich glaube, dies war das erste Mal, dass 30x auftauchte. Ich erinnere mich nicht, dass sie einen bestimmten Grund dafür hatten. Abbildung 5 in der veröffentlichten Veröffentlichung war kurz danach. Es erklärt nicht wirklich, warum nicht 25x oder 35x, da die Kurven zwischen 25x und 35x in dieser Figur ungefähr linear sind.

In der Zusammenfassung von Ajay et al. (2011) Die Autoren argumentierten, "die derzeitige Empfehlung einer ~ 30-fachen Abdeckung ist nicht ausreichend". Trotzdem scheint der Diskussionsteil darauf hinzudeuten, dass mit GAIIx 50- bis 60-fach erforderlich wäre, mit HiSeq2000 plus besserer neuerer Chemie jedoch 35-fach. Insgesamt bietet dieses Papier eine gründlichere Analyse. Die Datenqualität zu diesem Zeitpunkt ist auch näher an den Daten, die wir heute produzieren.

Die erforderliche Abdeckung wird weitgehend durch zwei Faktoren bestimmt: Leseplatzierungsverzerrung (z. B. GC-Verzerrung) und Basis- / Abbildungsfehlerrate. Während die GC-Verzerrung mit dem PCR-freien Protokoll reduziert wurde, ist die Basisfehlerrate seit HiSeq2500 rückläufig. Ich denke, eine 30-fache Abdeckung wäre erforderlich, wenn Sie die Empfindlichkeit mit den älteren 30-fachen Daten erreichen möchten. Illumina als Sequenzierungsdienstleister und unsere Sequenzierungsanlage bestehen weiterhin auf dem 30-fachen Schwellenwert.

30-fache Abdeckung ist nicht auf dieses Problem beschränkt, aber die Zahl 30 spielt eine empirische Rolle in der Statistik:

In der statistischen Analyse lautet die Regel von drei Wenn ein bestimmtes Ereignis in einer Stichprobe mit n Probanden nicht aufgetreten ist, ist das Intervall von 0 bis 3 / n ein 95% -Konfidenzintervall für die Häufigkeit des Auftretens in der Bevölkerung. Wenn n größer als 30 ist, ist dies eine gute Annäherung an die Ergebnisse empfindlicherer Tests.

Quelle: Wikipedia: Dreierregel (Statistik)

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• Was ist der Grund für die magische Zahl 30 in der Statistik?

Dementsprechend habe ich Datenverarbeitung in anderen Disziplinen gesehen, die n ≥ 30 für eine ausreichende Zuverlässigkeit der Ergebnisse erforderten.

Der Punkt, den ich in der Diskussion über die Berichterstattung immer vermisse, ist, dass niemand sagt, wie sie berechnet wurde. Wurden Duplikate entfernt? Wie zählen Sie überlappende Paired-End-Lesevorgänge? Als 2 oder 1? Nur um auf zwei Dinge hinzuweisen, die Einfluss auf die Berichterstattung haben.