Frage:
Wie kann ich die Ausbeute an MinION-Sequenzierungsläufen verbessern?
gringer
2017-05-31 14:48:19 UTC
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Dies ist eine häufig gestellte Frage innerhalb der Nanoporengemeinschaft. Oxford Nanopore behauptet derzeit, dass sie Laufausbeuten von 10 bis 15 Gigabasen generieren können (siehe z. B. hier und hier), und dennoch ist es üblicher, dass Benutzer nur in verwalten der Bereich von 1 bis 5 Gigabasis.

Warum also der große Ertragsunterschied?

Drei antworten:
#1
+12
gringer
2017-05-31 15:02:35 UTC
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Ich nahm an einem Vortrag von Josh Quick auf der PoreCampAU 2017 teil, in dem er einige allgemeine Hindernisse für eine gute Sequenzierungsausbeute und eine lange Leselänge erörterte. Es läuft hauptsächlich darauf hinaus, bei der Probenvorbereitung vorsichtiger zu sein. Denken Sie daran, dass der MinION immer noch eine schmutzige Probe sequenziert, nur mit reduzierter Ausbeute. Hier sind meine Notizen aus diesem Vortrag:

  • Das Schwierigste an der MinION-Sequenzierung ist, die Probe überhaupt erst zu erhalten.
  • Es gibt viele verschiedene Probentypen und Extraktionsmethoden
  • Sie können nicht länger lesen, als Sie eingegeben haben. Shit-In führt zu Shit-Out.
  • DNA ist sehr stabil, wenn sie sich nicht bewegt, aber sehr empfindlich gegenüber seitlichen Schäden.
  • Die Phenol-Chloroform-Methode zur DNA-Extraktion ist sehr gut und kann mit verwendet werden Ein phasenverriegeltes Gel zur Erleichterung der Extraktion
  • Eine einfache Salz + Alkohol-Extraktion ist möglicherweise die beste Methode zur Extraktion (da es den geringsten Arbeitsaufwand für die DNA erfordert).
  • EDTA (z. B. wie in TE-Puffer und vielen Extraktionskits gefunden) ist nicht kompatibel mit dem Schnellkit
  • Die beständigsten guten Nanoporenläufe, die von Joshs Labor hergestellt wurden, waren 1D-Ligationsläufe auf R9.4; Der beste Gesamtlauf war eine Phenol-Chloroform-Extraktion + ein schnelles Kit.
  • John Tyson kann sich (über Software) aus einem Loch mit geringer Ausbeute herausstimmen.
  • Es ist eine kleine Anzahl von kurzen Lesevorgängen sehr wichtig
  • Vorgeschlagene (und meist ungetestete) Reinigungstechniken: Spin-Säule (60-100 kb); Ethanolextraktion (100-150 kb), Dialyse (150-250 kb); Agarosestopfen mit niedrigem Schmelzpunkt (~ 1 MB, DNA-Extraktion in situ)
  • Die Eingabe des Nanoporenprotokolls erfolgt in Nanogramm, sollte jedoch als Molarität angegeben werden. Das Kit erwartet einen Input von ca. 0,2 pmol.
  • Bildmoleküle, die an die Oberfläche der Membran gebunden sind. Sie können dann sehen, dass die Durchflusszellendichte unabhängig von der Sequenzlänge
  • ist
  • Tapestation, Qubit und Nanodrop sind gute Ideen. Eine DNA-Probe, die alle drei Tests bestehen kann, funktioniert gut: Keine kurzen Schultern durch Tapestation, ausreichende DNA durch Qubit, hohe Reinheit durch Nanodrop
  • RNA kann die Sequenzierung stören; Es wird empfohlen, RNA zu verdauen.
  • Das Einfrieren von DNA ist eine wirklich schlechte Idee. Die Eiskristalle sind sehr gut darin, DNA in kleine Stücke zu hacken.
  • DNA, die im Kühlschrank aufbewahrt wird, ist bemerkenswert stabil. kann über zwei Jahre (und wahrscheinlich auf unbestimmte Zeit) aufbewahrt werden.

Aktualisierung der Ausbeute:

Wir hatten im Juni 2018 einen Lauf, der etwa 3 Millionen Lesevorgänge aus PCR- ergab. amplifizierte Maus-cDNA (lesen Sie N50 von ~ 1 kb), und das war in einer Situation, in der es sich um die erste von jemandem hergestellte Probe handelte, die eingegebene DNA-Menge wahrscheinlich etwa 20% der Menge betrug, die sie hätte sein sollen, und wir erlitten einen Datenverlust-Vorfall . Wenn das mit einem schlechten Lauf passiert ist, habe ich große Hoffnungen auf unsere Läufe in der Zukunft.

Unser nächster cDNA-Lauf im August 2018 ergab ungefähr 7 Millionen Lesevorgänge und einen ähnlichen Lese-N50 (dh eine Gesamtausbeute von ungefähr 7 GB). Der Lauf wurde in der ersten Nacht durch ein Windows-Update unterbrochen (ich hatte zuvor automatische Updates deaktiviert, diese wurden jedoch wieder aktiviert). Seitdem wurden zusätzliche Software- und Hardware-Updates durchgeführt, um die Sequenzierungsausbeute zu verbessern. Wenn wir eine gute Durchflusszelle und eine ähnliche Probenvorbereitung haben, erwarte ich, dass der nächste cDNA-Lauf, den wir durchführen, über 8 Millionen Lesevorgänge und möglicherweise über 10 Millionen Lesevorgänge produzieren wird.

#2
+2
roblanf
2017-06-10 08:52:26 UTC
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Ich wette, dass die Nanoporen-Leute (natürlich!) eine Menge Optimierungen an zwei wichtigen Dingen vorgenommen haben:

  1. Die DNA-Bereinigung
  2. Die Bibliothek bereitet sich vor
  3. ol>

    Ich denke, dass bei den meisten DNA-Extraktionen die Aufräumarbeiten sehr unterschiedlich sein können, aber so etwas wie ein Blue Pippin macht einen außergewöhnlichen Job, wenn Sie Zugriff auf einen haben und ihn verwenden können (sie funktionieren nicht) für SUPER lange DNA-Fragmente, die sich natürlich nicht durch ein Gel bewegen können). Der Blue Pippin nimmt auch Ihre Größenauswahl vor, damit Sie keine Poren ausbrennen, die viele kleine Dinge sequenzieren. Dies sollte auch zum Ertrag beitragen.

    Dann hängt alles von der Bibliotheksvorbereitung ab, und die Antwort von @ gringer enthält einige gute Tipps dazu.

#3
+1
Saidi Rahina Hussain
2018-10-27 01:28:34 UTC
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Ich arbeite mit einem Pilz und verwende die CTAB-Methode für die DNA-Extraktion. Ich habe ein Rapid-Kit für meine anfängliche Bibliotheksvorbereitung verwendet, aber es hat nicht funktioniert. Seitdem habe ich ein Ligations-Kit verwendet und es hat mir sehr gute Ergebnisse gebracht . Ich habe es geschafft, Daten im Bereich von 4 GB bis 13 GB zu erhalten.



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