Frage:
Die Auswirkungen einer unvollständigen Bisulfitumwandlung auf die Kartierungseffizienz
DDRRpy
2017-05-24 11:41:10 UTC
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Diese Frage wurde auch auf Biostars

veröffentlicht. Ich habe zahlreiche gemultiplexte Pools von BS-Amplikon-seq-Bibliotheken sequenziert, die aus menschlichen Proben auf a stammen MiSeq in den letzten Wochen. Ich habe Trim-Galore und Bismark für die Ausrichtung verwendet und finde, dass die Kartierungseffizienz für zwei Pools (55% & 30%), die beide über die gesamte Sequenz ein Cytosin pro Basensequenz von etwa 10 bis 20% aufwiesen, sehr niedrig ist Lesen Sie ihre FastQC-Dateien ein.

Der in den FastQC-Dateien sichtbare hohe C-Gehalt lässt mich glauben, dass die schlechte Zuordnungseffizienz auf eine schlechte Bisulfitumwandlung zurückzuführen ist, da erwartet wird, dass diese nahe Null bei der Bisulfitumwandlung liegt fand tatsächlich statt.

Ich bin neu auf dem Gebiet, daher wäre jede Hilfe sehr dankbar.

Es kann gut sein, sich mit den Schritten hinter der Abbildung von Bisulfit-konvertierten Lesevorgängen vertraut zu machen. In diesem Beitrag zu [Biostars] (https://www.biostars.org/p/107871/) gebe ich eine kurze Aufschlüsselung der Schritte, wenn Sie einen Blick darauf werfen möchten (aber natürlich ist viel Material verfügbar darauf).
Einer antworten:
#1
+7
Devon Ryan
2017-05-24 11:46:37 UTC
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Die Effizienz der Bisulfitumwandlung hat keinen Einfluss auf die Abbildungsrate in Bismark und ähnlichen Tools. Der Grund dafür ist, dass die Lesevorgänge vor der Ausrichtung vollständig in Silicium umgewandelt werden, um die Mapping-Verzerrung zu minimieren.

Ich würde vorschlagen, dass Sie mit den Einstellungen herumspielen, die bowtie2 übergeben wurden, z lokale Ausrichtung und Ändern der Option --score-min , um mehr Fehlanpassungen zu ermöglichen. Alternativ können Sie auch einen anderen Aligner wie bwameth ausprobieren, der immer die lokale Ausrichtung ausführt.

Vielen Dank. - Die lokale Flagge in den bowtie2-Dokumenten sieht vielversprechend aus. Ich werde es versuchen, wenn ich ins Büro komme. Wird Bismark bowtie2-Optionen / -Flaggen zu bowtie2 analysieren (ich frage, da --local nicht in Bisamark-Dokumenten vorhanden ist, sondern nur in bowtie2-Dokumenten)? Was kann ich über die hohe Cytosin-pro-Base-Sequenz in den FastQC-Dateien schließen? Ich habe allgemein festgestellt, dass dies in früheren Analysen bei 0% oder an den Enden bei 10% liegt. An diesem Punkt würde ich die Enden abschneiden.
Ich denke nicht, dass Bismark das "--local" -Flag korrekt handhaben wird, da erwartet wird, dass Lesevorgänge entweder vollständig ausgerichtet oder verworfen werden, ohne dass es zu einem weichen Clipping kommt.
Wenn die MBIAS-Diagramme nach dem Ausführen von bismark nicht relativ flach aussehen, können Sie einen Filterparameter an bismark_methylation_extractor übergeben, sodass z. Sie ignorieren die letzten 10 Bp jedes Lesevorgangs.
@719016: Sie haben vielleicht Recht, es ist ein paar Jahre her, seit ich mir den Bismark-Code angesehen habe. Ich versuche generell, ihn nicht zu verwenden, da er so unglaublich langsam ist und schlechte Ergebnisse liefert.
Wie Devon Ryan ebenfalls vorschlägt, möchten Sie vielleicht bwameth ausprobieren, eine einfache Hülle um bwa-mem, und die weich geschnittenen Ausrichtungen beibehalten, falls vorhanden. Sie können dann ein anderes Skript zum Zählen der CpGs von der BAM anwenden, z. dieses hier: https://github.com/dariober/bioinformatics-cafe/tree/master/bam2methylation
Ich empfehle im Allgemeinen [MethylDackel] (https://github.com/dpryan79/MethylDackel) für die Methylierungsextraktion und Qualitätskontrolle, aber ich bin voreingenommen: P.


Diese Fragen und Antworten wurden automatisch aus der englischen Sprache übersetzt.Der ursprüngliche Inhalt ist auf stackexchange verfügbar. Wir danken ihm für die cc by-sa 3.0-Lizenz, unter der er vertrieben wird.
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